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RESULTADOS (para ser completados en el laboratorio)

No. de la muestra

 

Muestra

Aspecto de la muestra *

Resultados de la baciloscopia **

 

 

 

 

 

 

Mucopurulenta

Sanguinolenta

Saliva

Negativo

Positivo (codificación)

 

 

 

 

 

 

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Examinado por :


 

 

Firma:


 


 

 

 

 

 

 

Fecha de Salida del resultado:

Día

 

Mes

 

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*Marcar con una X

**Escribir negativo o positivo

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

No. de la muestra

 

Muestra

Resultados del Cultivo

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Negativo

Positivo (codificación)

Contaminado

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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Identificación:

Mycobacterium tuberculosis


 

Micobacteria ambiental

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Realizado por :


 

Firma:


 

 

 

 

Fecha de Indicación:

 

 

 

Día

 

Mes

 

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Mod. 64-31-02

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GRUPO DE RIESGO

 

 

 

 

 

 

 

 

1- Contactos de casos TBp BAAR+
2- Exreclusos y reclusos
3- Personas viviendo con el VIH u otras inmunodepresiones.
4- Niños menores de 5 años y adultos ≥ 60 años
5- Alcohólicos
6- Diabéticos
7- Desnutridos
8- Personas con otras enfermedades crónicas (asma, EPOC, insuficiencia renal u otras)
9- Casos sociales y económicamente vulnerables: vagabundos, drogadictos y residentes en asentamientos críticos. Asentamiento Crítico: Es una instalación o territorio bien definido en el cual se observa un incremento del riesgo de transmisión de tuberculosis o de su incidencia)
10- Personas de unidades de salud con internamiento prolongado (hogares de ancianos y Centros Psicopedagógicos).
11- Personas con lesiones radiográficas pulmonares antiguas.
12- Colaboradores cubanos que prestan servicios en países de mediana y alta carga de TB.
13- Extranjeros residentes temporales procedentes de países de mediana y alta carga de TB.
14- Trabajadores del sector salud relacionados con la atención a pacientes.
15- Mineros

16- Fumadores

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Conservación y transporte


Mientras más rápido se procese la muestra en el laboratorio, mayor será la posibilidad del aislamiento de Mycobacterium tuberculosis, ya que la temperatura ambiente y el tiempo favorecen la multiplicación de los gérmenes habituales de la boca los cuáles desnaturalizan las proteínas, dificultando por tanto la elección de la partícula útil y favoreciendo la bacteriólisis.

Las muestras se deben trasladar al laboratorio que realizará el cultivo en un término de 72 horas. Aquellas muestras que no se puedan enviar de inmediato al laboratorio o que no se puedan procesar en el día, se deben conservar en refrigeración (temperatura entre 4 y 8°C). En caso de no contar con refrigeración, se deben enviar en el curso de las 24 horas de recolectada.

El transporte se realizará en un contenedor adecuado (hermético y esterilizable), exclusivo para los frascos con muestra.

La muestra se rotulará en el propio frasco (no en la tapa) con cinta adhesiva o, en su defecto, con papel engomado o papel y cordel; con el nombre y apellidos del paciente, número de historia clínica y área de salud.

Las órdenes con los datos generales de identificación, más las especificaciones médicas del caso (SR+21, contacto TB, PVVIH u otro grupo de riesgo), se enviarán en un sobre separado de los frascos de muestras.

No se aceptarán muestras incorrectas o no útiles (saliva, muestras derramadas, muestras escasas y secas, frascos no rotulados o identificados indebidamente).

En el laboratorio se registrarán las muestras recibidas en el Libro de Registro de Exámenes de Laboratorio de Tuberculosis.

Una vez terminado el procedimiento de las muestras, todos los frascos y tubos se deberán esterilizar (pág. 171).


Baciloscopia

  1. La baciloscopia es la técnica principal de diagnóstico en la que se sustenta el PNCT. Esta es fácil, rápida y barata, siendo útil tanto para la detección de los casos más infecciosos (BAAR+) como para el seguimiento evolutivo mensual de los casos de TBp en tratamiento. Realizar coloración de ZN.

En el laboratorio, la única forma de lograr un técnico experimentado y con las habilidades necesarias para obtener una baciloscopia de calidad, es garantizar la estabilidad de un personal fijo en esta actividad.

La codificación utilizada en el PNCT en Cuba se basa en la observación, en cada lámina, de dos líneas horizontales y dos líneas verticales, con un recorrido aproximado de 250-300 campos ópticos. El conteo de bacilos y la codificación (de 0 a 9) se explican en la pág. 151 del presente capítulo.

Para que la baciloscopia sea positiva es preciso como mínimo, entre 5.000 y 10.000 bacilos por mililitro de muestra. La técnica que se utiliza en nuestro país es la coloración de Ziehl-Neelsen (ZN) mediante la cual las micobacterias se tiñen de color rojo fucsia al captar la fucsina y retenerla en su interior, luego de un proceso de decoloración con una mezcla de alcohol y ácido. La propiedad ácido alcohol resistente la comparten todos los miembros del género Mycobacterium, pero también otras bacterias relacionadas (Rhodococcus, Nocardia). Por lo tanto, el resultado de esta prueba no es conclusivo.


Cultivo

El cultivo bacteriológico, es la técnica de referencia para el diagnóstico definitivo de la TB. Mediante este, es posible aumentar la confirmación del diagnóstico de TB del 15-20% del total de casos y del 20-30% de los pacientes con TB pulmonar, además permite detectar a los enfermos de forma temprana, con frecuencia antes de volverse altamente infecciosos.

El cultivo produce resultados tardíamente pero es más sensible que la baciloscopia. Puede evidenciar un mínimo de 10 a 100 bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) presentes en una muestra, si se realiza en forma adecuada. El cultivo de la muestra es necesario para aislar la micobacteria, realizar la identificación y la prueba de susceptibilidad. Previamente, la muestra se debe someter a un proceso de descontaminación para eliminar la flora acompañante y de esta forma evitar la contaminación de los medios de cultivo.

Se conocen varios métodos de pretratamiento empleados para este examen como son: el método de Petroff modificado (el recomendado), el de Kudoh-Ogawa, del laurilsulfato (de Tacquet y Tison) el método de agitación y precipitación lenta (de Valdivia et al.), Método del Ácido Sulfúrico (H2SO4) al 4% (para muestras extrapulmonares), etc (pág. 163).

Se enviará a cultivar el 100% de las primeras muestras de esputo de los SR+21 detectados. Se mandarán todas las muestras con indicación médica, en pacientes sospechosos de TB. Estas muestras se remitirán a los centros provinciales (CPHEM) y unidades seleccionadas, donde se realiza el cultivo (siembra en dos tubos) y las pruebas de identificación de especie. Todos los laboratorios provinciales deben garantizar la viabilidad de las cepas para su envio al LNR-TB del IPK. En caso de que la muestra enviada a cultivo no sea útil (escasa, saliva), se indicará repetir esta.

Si se sospecha TBe, se deben procesar por cultivo todas las muestras enviadas, pues la escasa cantidad de bacilos así como la presencia de micobacterias saprófitas hacen que la baciloscopia sea menos efectiva.

La codificación utilizada en Cuba se basa en la observación y el conteo de colonias en los tubos con crecimiento; en un rango de 0 a 9 (pág. 152).


Otras técnicas para la identificación del complejo M. tuberculosis.


Cultivo rápido de micobacterias

Solo se realiza en el LNR-TB del IPK, el cual dispone del equipo automatizado BacT/ALERT 3D (Biomérieux, Francia) para el diagnóstico rápido de micobacterias en medio líquido. Este sistema tiene una alta sensibilidad y especificidad, es un sistema no invasivo, permite la monitorización y detección rápida de forma sensible y confiable de las micobacterias en muestras clínicas pulmonares y extrapulmonares. El tiempo de detección de crecimiento para el complejo M. tuberculosis oscila entre 11 y 13 días como promedio y para las micobacterias de crecimiento rápido de 2-3 días.

Después de varios años de trabajo con el equipo BacT/ALERT 3D en el LNR-TB del IPK el tiempo promedio de crecimiento de M. tuberculosis ha sido de 16 días, acortando considerablemente el tiempo con relación al método convencional utilizado (cultivo en medio Löwenstein-Jensen).

Debido al costo de los insumos y la dificultad para conseguirlos, el empleo de esta tecnología se limita a casos graves, PVVIH, niños o de algún grupo de alto riesgo y esta en dependencia de la disponibilidad de recursos.


Diagnóstico molecular por PCR


Actualmente las técnicas moleculares se han convertido en una herramienta importante para la identificación de micobacterias, fundamentalmente en aquellos casos donde los métodos tradicionales para lograr este fin no son suficientes para demostrar la infección por M. tuberculosis.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) detecta M. tuberculosis mediante la amplificación del ADN purificado directamente de los especímenes clínicos, sin necesidad de realizar el cultivo. Con la PCR se puede lograr un diagnóstico oportuno (24-48 horas), eficiente y específico del complejo M. tuberculosis, pues permite detectar cantidades muy pequeñas del material genético de este patógeno en muestras clínicas, incluso antes de que el huésped pueda brindar una respuesta inmune o producir algún tipo de anticuerpos.

Como se conoce la muestra por excelencia para el diagnóstico de TB es el esputo y para este la sensibilidad y la especificidad de la PCR son muy elevadas (90-100%) y con valores predictivos positivo y negativo también muy altos, sobre todo en muestras con baciloscopia positiva. Existen múltiples publicaciones científicas que avalan estos planteamientos incluidos artículos de revisión y metanálisis; sin embargo, los resultados más reproducibles se han obtenido empleando sistemas comerciales.

A pesar de esto, se pueden analizar por PCR otras muestras como: lavados broncoalveolares, jugo gástrico, derrames pericárdicos, derrames pleurales, líquido ascítico, líquido cefalorraquídeo, orina, tejidos frescos y embebidos en parafina y en general, casi cualquier fluido o tejido corporal donde se sospeche que se encuentra la bacteria.

El Departamento de Anatomía Patología del Hospital del IPK introdujo en el 2008 la técnica de la PCR para detectar M. tuberculosis en tejidos fijados en formol y embebidos en parafina de muestras procedentes de PVVIH. En estos momentos, el colectivo de investigadores trabaja en la implementación de esta tecnología en otros tipos de muestras diferentes al esputo recibidas en el IPK de diferentes provincias del país. Esta metodología ha posibilitado brindar un diagnóstico rápido, oportuno y confiable para tuberculosis en PVVIH, indicándose específicamente para estos casos.

Recientemente, ha aparecido en el mercado un sistema comercial de PCR en tiempo real, el Xpert MTB/RIF (Cepheid, EE.UU.), sistema automatizado de amplificación de ácidos nucleicos (basado en un cartucho) para el diagnóstico rápido (en 100 minutos) de la TB. Este realiza el proceso de extracción, amplificación y detección de ADN en condiciones de bioseguridad. Xpert MTB/RIF detecta M. tuberculosis y las mutaciones que confieren resistencia a Rifampicina, directamente de esputo, con elevados valores de sensibilidad y especificidad. Se hacen numerosas gestiones para la adquisición de este equipamiento y sus reactivos que brindaría servicio en el LNR-TB del IPK. El costo de los insumos, su disponibilidad y el mantenimiento del equipo hace que su uso sea indicado solamente para casos graves, PVVIH, sospechosos de TB-MDR, niños u otros pacientes pertenecientes a algún grupo de alto riesgo.


Identificación del complejo M. tuberculosis


Se realiza fundamentalmente a través de las pruebas bioquímicas convencionales: Niacina y termoestabilidad o inhibición de la enzima catalasa 68°C (pág.157). Sin embargo, la elevada peligrosidad y toxicidad de los reactivos que se emplean en la prueba de la niacina y el proceso cada vez más complejo para adqurirlos ha conllevado al desuso de esta prueba bioquímica.

En cambio, el ensayo para la identificación rápida de Micobacterias por inmunocromatografía lateral SD Bioline TB AgMPT64 Rapid (Standard Diagnostics, Corea) cada día gana más adeptos. Este método utiliza anticuerpos monoclonales para la detección del antígeno MPT64, presente solamente en el complejo M. tuberculosis. Esta prueba es rápida, fácil de realizar, presenta una sensibilidad de 99% y especificidad de 100%, no se requiere de personal altamente calificado ni de un equipamiento sofisticado. En los últimos años este sistema comercial se ha adquirido con financiamiento del proyecto del Fondo Mundial y se ha distribuido a la red de laboratorios para su utilización. Por todo lo antes mencionado, dicho ensayo goza de gran popularidad entre los micobacteriólogos del país eliminándose considerablemente los riesgos de la prueba de la niacina. No obstante, por su costo elevado su uso se debe limitar a la confirmación exclusiva del complejo M. tuberculosis, luego de descartar otra micobacteria a través de las características culturales, la velocidad de crecimiento, su pigmentación y la realización del ensayo de la catalasa a 68°C.


Resistencia


El LNR-TB del IPK ha adoptado un sistema centinela de vigilancia de la fármaco-resistencia. Este sistema reporta continuamente los resultados de las pruebas de sensibilidad de todos los casos de TBp BAAR(+) primocultivo con más de 10 colonias.

El LNR-TB ha incorporado recientemente nuevos métodos rápidos (fenotípicos y genotípicos) para la detección de resistencia. Estos métodos han sido recomendados por la OMS y permiten realizar un tamizaje rápido de pacientes portadores de cepas MDR. El método de la nitrato reductasa (MNR) ha sido el más utilizado y permite detectar la resistencia a Isoniacida y Rifampicina en 10-14 días.

A los aislamientos resistentes mediante el MNR, se les confirmará el resultado por el método de las proporciones donde se incluirá también, el estudio de susceptibilidad a Estreptomicina y Etambutol. A aquellas cepas que resulten MDR, se les investigará además la susceptibilidad a drogas de segunda línea (Ofloxacina, Capreomicina y Kanamicina). En dependencia de los recursos disponibles, estos aislamientos serán investigados (simultáneamente), mediante el empleo del estuche de biología molecular Genotype MTBDRplus (Hain Lifesciences, Alemania), para detectar mutaciones en los genes katG e inhA, relacionados con la resistencia a Isoniacida, y en el gen rpoB, responsable de la resistencia a Rifampicina. De igual manera, estos aislamientos se evaluarán mediante el estuche Genotype MTBDRsl (Hain Lifesciences), lo cual permitirá conocer la presencia de mutaciones en los genes gyrA, rrs y embB, responsables de la resistencia a Fluoroquinolonas, aminoglucósidos/péptidos cíclicos y Etambutol, respectivamente. Ambos métodos ofrecen resultados en 48 horas.

Además queda establecido lo siguiente:


1.- Los laboratorios provinciales de Tuberculosis (LPTB) enviarán al Laboratorio Nacional de Referencia (LNR-TB) el 100% de los aislamientos de M. tuberculosis. Según lo establecido, sólo se estudiarán los aislamientos obtenidos de muestras con baciloscopía positiva y la ampliación de todos los cultivos positivos con al menos de 10 colonias de los casos BAAR(+) y todo caso con elevada sospecha de MDR, seropositivos al VIH y previamente tratados (fracasos, recaídas, abandonos) ó cualquier otro caso de interés epidemiológico con previa coordinación con el LNRITBM y la dirección del PNCT. Los fracasos deben ser estudiados el 100% y las cepas deben ser clasificadas de manera urgente, según pruebas de sensibilidad.

2.- Cada aislamiento se enviará al LNR-TB con la encuesta correspondiente según la metodología establecida (pág. 167). Los responsables del programa y del laboratorio de cada provincia serán los responsables del llenado de la misma; es imprescindible verificar la veracidad del dato referente al acápite de tratamiento anterior. Se considera que el paciente ha recibido tratamiento previo cuando ha sido tratado con una o más de las drogas antituberculosas, durante 30 días o más, previo a su notificación.

3.- Con respecto a los casos nuevos, será investigada la susceptibilidad del primo aislamiento y de aquellos que se obtengan al tercero, quinto y sexto mes de tratamiento. En el caso de un paciente previamente tratado, se estudiará la susceptibilidad de los aislamientos primarios y de aquellos que se obtengan al tercero, quinto y octavo mes de retratamiento. Cada uno de estos aislamientos será remitido al LNR-TB acompañado de una encuesta donde se refleje en cuál etapa de tratamiento se encontraba el paciente en el momento en que se realizó el cultivo.

4.-Con respecto a los pacientes MDR, el LNR-TB garantizará el estudio de susceptibilidad a las drogas de segunda línea.

El LNR-TB informará los resultados de la vigilancia en las categorías de casos nuevos y casos previamente tratados. El LNR-TB enviará los resultados de susceptibilidad de manera mensual a la Dirección Nacional de Epidemiología, al Jefe de Programa de cada provincia, y al laboratorio provincial que mandó el aislamiento. La detección de un caso MDR, así como también los casos monoresistentes a Isoniacida y Rifampicina, se informarán de manera inmediata a la dirección del programa, al HNBJ y a la provincia.



Determinación de patrones genéticos

Las dos técnicas que más se emplean en la actualidad a nivel internacional son la tipificación con oligonucleótidos espaciadores (Spoligotyping, abreviatura en inglés) y la tipificación con unidades repetitivas interespaciadas de micobacterias- repeticiones en tándem de número variable (MIRU-VNTR, siglas en inglés). Recientemente, se ha propuesto a la tipificación con MIRU-VNTR como técnica de referencia en lugar del análisis polimorfismo de los fragmentos de restricción (RFLP) con la sonda IS6110. Por la elevada resolución de la tipificación con MIRU-VNTR (cercana o superior a la del RFLP) varios países desarrollados, de gran tradición en la lucha contra la TB, la han adoptado como la herramienta fundamental de caracterización del complejo M. tuberculosis y de determinación de los patrones de transmisión.

El LNR-TB introdujo en 2009 la técnica de MIRU-VNTR-15 loci y en estos momentos se trabaja en la implementación de esta tecnología en la caracterización genotípica de la mayoría de los aislamientos recibidos en el IPK procedentes de todas las provincias el país.

Resultados preliminares de la aplicación de este método molecular en el LNR-TB han reportado un alto porcentaje de agrupamiento en aislamientos provenientes de la antigua provincia Ciudad de La Habana (2009) lo que sugiere que la transmisión reciente podría tener influencia en la incidencia de TB en esa provincia.

En cambio, la técnica de Spoligotyping se evaluó con aislamientos cubanos en 1996-1997, demóstrando su valor como herramienta de primera línea de genotipificación debido fundamentalmentea su rapidez, sencillez de interpretación y formato multimuestras. No obstante, no fue hasta 2010 (con recursos del proyecto del fondo mundial) que su utilización se ha hecho amplia como primera barrera de caracterización genética, realizándose el análisis de cientos de aislamientos de todas las provincias del periodo 2009-2012.

Se trabaja por instaurar la determinación de los patrones genéticos de todos los aislamientos cubanos (con baciloscopia + o -) de manera sistemática y mayoritaria, para ayudar en la detección más temprana y oportuna de las fuentes de infección en instituciones cerradas y en la comunidad y tomar medidas adecuadas para el control de la enfermedad en donde lo requiera.


Control de calidad de la baciloscopia.


Todo laboratorio de la RND que realice el diagnóstico microbiológico de la TB (baciloscopia o cultivo) está sujeto a un control de la calidad diagnóstica (sección 1.5 pág. 180) estructurado como sigue:

Control de calidad interno: lo realiza el jefe de laboratorio con el personal asignado a esta actividad y contempla los elementos siguientes:

  1. Personal: el técnico que realice la baciloscopia estará verticalizado en esta actividad. Además, existirá constancia por escrito de su adiestramiento en el diagnóstico y de las evaluaciones periódicas realizadas (supervisiones).

  2. Equipamiento:

  • Procedimientos para el mantenimiento del equipo.

  • Existencia de láminas control para la evaluación del microscopio y cartas control de temperatura.

  1. Ambiente:

  • Procedimientos de desinfección y esterilización.

  • Condiciones adecuadas de trabajo.

  1. Registros:

  • Manual de procedimientos técnicos.

  • Registro de muestras.

  • Registro de casos de TB, láminas positivas y de seguimiento de casos.

  • Otros documentos de control en el laboratorio (resultados, remisión de láminas para control, de remisión de cepas, lotes de reactivos y alteraciones de los mismos, control de reactivos y medios).

  1. Procederes diagnósticos:

  • Baciloscopia.

  • Cultivo.

Control de calidad Externo: Es un sistema de comparación retrospectiva, periódico y objetivo de los resultados de diferentes laboratorios, y se debe realizar por un laboratorio de referencia (externa). Existen dos modalidades: rechequeo de láminas a ciegas y el panel de láminas.


Rechequeo de láminas a ciegas: se basa en la remisión de láminas para el control de calidad a los centros de referencia. Las áreas de salud, hospitales y otras unidades que realizan la baciloscopia enviarán hacia los centros de referencia correspondiente (CPHEM) el 100% de las láminas positivas y el 10% de las láminas negativas realizadas en el mes. El envío se hará con el registro de láminas pero sin el resultado de la baciloscopia. Se realizará una evaluación macroscópica de la extensión y coloración de cada una de ellas.


Control de calidad del medio de cultivo


Interno (Ver sección 1.5)

I. Controles cuando se prepara el medio de cultivo: aspecto (color, consistencia, textura/homogeneidad), sensibilidad, esterilidad, registro de elaboración o recepción, control y consumo de medios de cultivo.

II. Seguimiento de los resultados periódicos del cultivo: aporte del cultivo al diagnóstico, porcentaje de muestras baciloscopia (+) cultivo (-), relación entre resultados de baciloscopia y cultivo, tasa de contaminación.

Los laboratorios de referencia provinciales, serán los encargados de elaborar, controlar, evaluar e informar el LNR-TB y este a la Dirección Nacional del Programa y a la Dirección Nacional de Estadísticas, todo lo relativo al control de la calidad en los laboratorios de la Red.

Externo

El LNR-TB trabaja en estos momentos en una metodología para regular racional y efectivamente este proceso en la red de laboratorios.


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