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Sección I: Procedimientos de la red de laboratorios de TB


I.I- Procedimiento para el examen de esputo, cultivo e identificación bioquímica de los aislamientos.


Examen de esputo

El examen bacteriológico del esputo constituye la técnica de elección para la búsqueda de casos de TB pulmonar en los programas modernos para el control de esta enfermedad.

El examen directo o BK, permite la determinación de bacilos ácido alcohol resistente (BAAR) y tiene un valor prioritario en el diagnóstico de la TB, porque detecta la principal fuente de infección (los mayores excretores de bacilos) para proceder a su inmediato tratamiento y control. Además, la BK es eficaz para el control bacteriológico del tratamiento quimioterapéutico y por su simplicidad y bajo costo permite una amplia cobertura en el diagnóstico.


Extensión del frotis

  1. Seleccionar con el asa o un aplicador una partícula de la parte más purulenta de la muestra.

  2. Extender la muestra seleccionada en 2/3 de un portaobjetos por medio de movimientos a lo largo de éste (el material debe quedar homogéneamente distribuido y ocupar no menos del 60% de la superficie). La extensión debe ser adecuada, ni muy fina, ni muy gruesa, para observar los elementos individualizados.

  3. Utilizar el tercio restante de la lámina para su identificación, lo que se hará siempre por la cara opuesta a la extensión.

  4. Secar al aire (o en plancha caliente, incubadora, etc.) y fijar a la llama por la cara opuesta.


Coloración

  1. Cubrir la extensión con la solución de fucsina básica-fenicada filtrada.

  2. Calentar por la cara opuesta hasta la emisión de vapores evitando que hierva (dejar actuar 5 min, calentar tres veces en este intervalo de tiempo).

  3. Lavar con agua y escurrir

4. Decolorar con ácido-alcohol al 3% o ácido sulfúrico al 20% durante 2 min. Si quedara muy rojiza la lámina, se vuelve a decolorar por 2 min. .

5. Lavar con agua y escurrir

6. Colorear con azul de metileno al 0,1% durante 45 seg.

7. Lavar con agua y escurrir

8. Secar al aire.


Observación microscópica

  1. Usar lente de inmersión, para lograr, preferiblemente, aumentos aproximados de 700x o 1000x, en dependencia del ocular utilizado (de 7x o 10x)

  2. Observar, campo a campo, 2 líneas horizontales y 2 líneas verticales, (aproximadamente 250 a 300 campos).

  3. Sumar los bacilos encontrados en el recorrido; no es necesario contar más de 25 de ellos.


Diagnóstico presuntivo

La codificación establecida se basa en el conteo realizado en la observación aproximada de 250 - 300 campos, según los rangos que se muestran en la Tabla I.I.


Tabla I.I. Conteo de bacilos. Rangos para la codificación

No. de bacilos

Codificación

0 en las 4 líneas

0

1- 5 en las 4 líneas

El propio No.

6-24 en las 4 líneas

6

25 o más en las 4 líneas

7

25 o más en 1 línea

8

Bacilos en la mayoría de los campos

9


Informe: Se informará el número que corresponda, según el número de bacilos encontrados.

La codificación anterior es la utilizada dentro del PNCT en Cuba. En el Manual para el Diagnóstico Bacteriológico de la Tuberculosis. Parte I. Baciloscopía, OPS, 2008 se recomienda para países de alta prevalencia de TB la escala semi-cuantitativa siguiente:

  1. (-) No se encuentran BAAR en 100 campos microscópicos observados.

  2. (+) Menos de 1 BAAR por campo, en 100 campos microscópicos observados.

  3. (++) De 1 a 10 BAAR por campo, en 50 campos microscópicos observados.

  4. (+++) Más de 10 BAAR por campo, en 20 campos microscópicos observados.


En caso de que se encuentre sólo de 1 a 4 bacilos en 100 campos microscópicos observados se debe ampliar la lectura a otros 100 campos, para lo cual se debe utilizar una nueva línea en la misma preparación y hacer el informe de acuerdo con lo observado.

Al presentar el informe se debe solicitar una nueva muestra si, después de observar 200 campos, la cantidad de bacilos encontrados se mantiene entre 1 y 4. También se debe pedir una nueva muestra cuando ésta sea deficiente (bien por su cantidad o por su calidad) y el resultado sea negativo. Aún así, de toda muestra se debe realizar CU, porque puede dar resultados positivos (Manual para el Diagnóstico Bacteriológico de la Tuberculosis. Parte I. Baciloscopía, OPS, 2008).


Método del esputo concentrado con hipoclorito de sodio:

  1. Mezclar igual volumen de esputo con hipoclorito de sodio al 5% en tubos con tapa de rosca.

  2. Agitar la mezcla (puede ser usado un agitador).

  3. Mantener en reposo el tubo durante 15 min. a temperatura ambiente.

  4. Añadir agua destilada estéril hasta 50 mL.

  5. Centrifugar el tubo a 3 000 g, durante 15 min.

  6. Decantar el sobrenadante y dejar el sedimento.

  7. Resuspender el sedimento con varias gotas de agua y preparar el frotis con 1 gota del sedimento sobre la lámina portaobjeto.

  8. Secar al aire.

  9. Fijar la lámina en el mechero.

  10. Realizar coloración de ZN.


Cultivo del esputo

El examen por cultivo (CU), debido a su mayor sensibilidad, permite incrementar la localización de casos cuando el examen directo es negativo. Así mismo, el CU adquiere una gran relevancia en la TBe. Sólo en el cultivo y en la identificación del agente etiológico pueden diferenciarse otras manifestaciones patológicas no tuberculosas, causadas por micobacterias. Teniendo en cuenta esto, se hace necesario recomendar y normalizar los métodos que se utilizarán en el diagnóstico y seguimiento bacteriológico de la TBp, que constituye más del 90% de los casos; además, sugerir las técnicas que se deben utilizar en la detección de otras formas de TB y micobacteriosis.


Métodos de pretratamiento

1- Método de Petroff modificado (recomendado): se realiza con el objetivo de descontaminar productos patológicos no estériles o contaminados para diagnóstico de TB (v. gr. Esputo, Lavado Bronquial y Heces Fecales).

Fundamento: Como descontaminante y homogenizante, se utiliza una solución de hidróxido de sodio (NaOH) al 4%; una concentración mayor resultaría más homogenizante, aunque también más letal para las micobacterias, mientras que una concentración menor no provocaría una buena homogenización.

Procedimiento

  1. Para X ml de muestra, agregar X ml de NaOH al 4%.

  2. Homogenizar exhaustivamente en Vórtex por unos segundos.

  3. Dejar en reposo durante 15 min. a temperatura ambiente y agitar ocasionalmente.

  4. Centrifugar a 3000 g durante 15 min.

  5. Decantar el sobrenadante.

  6. Agregar 15 ml de solución salina o agua destilada estéril y resuspender el sedimento.

  7. Centrifugar a 3000 g durante 15 min.

  8. Decantar el sobrenadante.

  9. Resuspender el sedimento en solución salina o agua destilada estéril

  10. Inocular 0,2 ml en dos tubos del medio UIT.

2- Método del Ácido Sulfúrico (H2SO4) al 4%: se realiza con el objetivo de descontaminar productos patológicos no estériles o contaminados para diagnóstico de TB de muestras extrapulmonares, tales como: orina, líquido pleural u otro líquido orgánico purulento, biopsias y producto de autopsia, lavado gástrico, ganglios linfáticos, exudado de lesiones y pus.

Fundamento: El agente descontaminante H2SO4 al 4% es poco agresivo para las micobacterias, por lo que constituye un método para aquellos productos patológicos pobres en estos organismos.

Procedimiento

    1. Para X ml de muestra, agregue X ml de H2SO4 al 4%.

    2. Reposar a temperatura ambiente durante 15 min.

    3. Agregar 15 ml de solución salina.

    4. Centrifugar a 3000 g durante 15 min.

    5. Decantar el sobrenadante.

    6. Resuspender el sedimento en 3 ml de solución salina.

    7. Adicionar una gota de rojo fenol (aparición de color amarillo).

    8. Adicionar gota a gota NaOH al 4 % hasta aparición de color rojo.

    9. Inocular 0,2 ml en medio LJ.

3- Método del laurilsulfato (de Tacquet y Tison):

  1. Tener preparados tubos con tapa de rosca y retapa de goma que contengan 3 mL de una solución de:



Laurilsulfato de sodio

3 g

Hidróxido de sodio puro (perlas)

1 g

Agua destilada

100 mL


Esta solución debe permanecer guardada en la incubadora a 37°C no más de 1 semanas, para evitar precipitación.

  1. Aspirar el esputo con pipetas de punta de abertura ancha, con una pera de goma y se humedecen con agua, o mejor en la propia solución de laurilsulfato. Se agitan los tubos en un agitador y se colocan horizontalmente durante 40 min.

  2. Centrifugar a 3 000 g durante 15 min; se decanta el sobrenadante y se procede a la neutralización con solución de:


Ácido fosfórico puro

1,5 mL

Bromocresol púrpura 1/250

2,0 mL

Agua destilada

1 000 mL

Se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min.

  1. Centrifugar nuevamente a 3 000 g durante 15 min; luego se decanta el sobrenadante y se deja una pequeña porción de líquido en contacto con el sedimento, se agita o se procede a sembrar dicho sedimento en medio UIT. Se sembrarán dos tubos como mínimo.

  2. Incubar los medios a 37 °C durante 8 semanas.

4- Método de agitación y precipitación lenta (Valdivia et al.):

  1. Tomar 2 mL de esputo con una pipeta, previamente humedecida con agua estéril, o con la propia solución de fosfato trisódico y verterlos en un tubo con tapa de rosca que contenga 2 mL de Na3PO412H2O al 23%.

  2. Añadir 2 gotas de sulfato de bario al 5%, previa agitación del frasco.

  3. Agitar fuertemente durante varios segundos hasta homogenizar (puede hacerse con la mano). Si es necesario se repite la agitación hasta homogenizar completamente.

  4. Colocar los tubos en la incubadora a 37°C, verticalmente durante 18 a 24 h (hasta el día siguiente). A partir de este momento el tubo no debe agitarse ni moverse.

  5. Introducir una pipeta de 1 mL, graduada en 0,1 mL (con propipeta adaptada), a través del líquido sobrenadante, para evitar la entrada de éste por el control de la presión interna del aire.

  6. Sembrar, con la misma pipeta, de 0,1 a 0,2 mL (de 2 a 4 gotas) en la superficie de la cuña de medio, en cada uno de los tubos con medio. Dejar en posición inclinada durante 48 h con tapa floja a 37°C.

  7. Ajustar ligeramente las tapas y ordenar verticalmente los tubos en la gradilla definitiva e incubar a 37°C.

5- Método de Kudoh:

  1. Tener preparado lo siguiente:

  • Hisopos con algodón estériles

  • Tubos de 100 x 25 que contengan 5 mL de NaOH al 4%

  • Medio de Ogawa modificado por Kudoh:

Fosfato monopotásico

2 g

Citrato de magnesio

0,1 g

Glutamato de sodio

0,5 g

Glicerina

4 mL

Agua destilada

100 mL

Huevo homogeneizado

200 mL

Verde malaquita al 2 %

4 mL

  1. Esterilizar los hisopos, envueltos en papel o en tubos, en autoclave 15 min a 121°C.

  2. Tomar la muestra del esputo con hisopo, el cual se embebe y de inmediato se sumerge en los tubos con NaOH al 4% por 2 min, luego se saca el hisopo con cuidado para que no se pegue a la pared interna del tubo. Se siembra directamente en 2 tubos de CU y se incuba a 37°C durante 8 semanas.

Nota: todos los medios de CU que aquí se mencionan, utilizados en los métodos de pretratamiento, se explican en la página 174.

Los métodos que no usan centrífuga (3 y 4) son recomendables para aquellos laboratorios de pocos recursos que tienen dificultades con las centrífugas, otros equipos y la energía eléctrica.


Lectura

Para cualquiera de los métodos utilizados, la primera lectura se realiza a los 7 días y después, semanalmente hasta las 8 semanas. Si no hay crecimiento en ese tiempo, los CU se eliminan como negativos.

De existir crecimiento, primeramente se realizará un frotis de la colonia y se verifica la presencia de BAAR por la tinción de ZN. Posteriormente se cuenta el número de colonias en el tubo de mayor número y se le asigna una codificación, basada en el conteo de las colonias (tabla I.II).


Tabla I.II. Codificación del cultivo

No. de colonias

Codificación

Ninguna

Negativo

1-5

El propio No.

6-24

6

25-100

7

Más de 100

8

Crecimiento confluente

9


Una vez que se verifica la presencia de BAAR, en los tubos con escaso crecimiento se realizará subcultivo (en dos tubos de medio LJ) y se incuban a 37°C de 3 a 4 semanas para realizar las pruebas de identificación bioquímica, en el caso donde la codificación del CU sea alta y tenga más de 3 semanas de incubación, se procederá a realizar las pruebas de identificación, sin realizar el subcultivo.

Pruebas de identificación bioquímica

  1. Prueba de la Niacina

Fundamento: La niacina (ácido nicotínico) desempeña una función vital en las reacciones de oxidorreducción que se producen durante los procesos metabólicos de las micobacterias. Esta actúa como precursor en la biosíntesis de coenzimas. Aunque todas las micobacterias producen niacina, M. tuberculosis acumula una mayor cantidad de ácido nicotínico y su detección es útil para el diagnóstico definitivo. En la prueba, el ácido nicotínico reacciona con el bromuro de cianógeno dando lugar a una sustancia que al unirse a una amina aromática como la anilina o la bencidina, forma una compuesto final que se colorea de amarillo o rosado respectivamente.


Reactivos

- Solución de Anilina al 4%

Anilina incolora y transparente..................................................4,0 ml

Etanol al 95%............................................................................96 ml

Disuelva la anilina en el etanol y envase en un frasco de color ámbar. Conserve a 4ºC. Si la solución se torna amarilla luego de un período de almacenamiento; descártela.

- Solución de bencidina al 3%

Bencidina....................................................................................3,0 g

Etanol al 95%............................................................................100 ml

- Solución de Bromuro de cianógeno al 10%

(a partir de Bromuro de cianógeno, calidad reactivo)

Cristales de Bromuro de cianógeno...............................................5 g

Agua destilada...............................................................................50 ml

Agregar los cristales de bromuro de cianógeno al agua destilada. Conservar a 4ºC en frasco color ámbar. Prepare sólo pequeñas cantidades de este reactivo ya que el bromuro de cianógeno es volátil y su concentración disminuye durante el almacenamiento prolongado. Las soluciones menos concentradas ofrecen falsos negativos.

(a partir de Bromo)

Adicionar 4 ml de agua destilada en un erlenmeyer.

Adicionar 0,2 ml de Bromo y agite (coloración amarillenta).

Adicionar gota a gota una solución de cianuro de sodio o de potasio al 10% y agite por rotación constantemente (coloración incolora).

El bromo se disuelve parcialmente en el agua (quedando una parte sin disolver) y torna amarillenta la solución. En la medida que se añade cianuro, éste va reaccionando con el bromo disuelto, formándose bromuro de cianógeno al mismo tiempo que se disuelve el residuo de bromo hasta desaparecer. Cuando esto ocurre, todavía la solución mantiene su coloración amarillenta. Entonces, se continúa adicionando cianuro hasta que desaparezca la coloración, obteniéndose una solución de bromuro de cianógeno al 10% aproximadamente. Se conserva a 4ºC por varias semanas.

- Solución de NaOH al 4%

Hidróxido de sodio en lentejas (calidad analítica)............................... ..4 g

Agua destilada....................................................................................100 ml

Disuelva el hidróxido de sodio en el agua destilada y esterilice colocando en un autoclave a 121ºC durante 15 min.

Procedimiento

  1. A un tubo con abundante crecimiento, y de 3 a 4 semanas de incubación, añadir de 0,5 a 1 mL de agua destilada; remover las colonias con el asa y se realizar hendiduras en el medio, posteriormente colocar en posición inclinada, de forma tal que el líquido bañe la superficie del medio. Finalmente, se incubar a 37°C durante 30 min como mínimo.

  2. Colocar el tubo en posición vertical y extraer, con pipeta, de dos a tres gotas del líquido y colocar en un tubo serológico de 12 x 75.

  3. Agregar de una a dos gotas de solución alcohólica de bencidina al 3% y agitar ligeramente.

  4. Añadir de una a dos gotas de bromuro de cianógeno al 10%, agitar y esperar 5 min.

Lectura:

  • Reacción positiva aparición de un color rosado que puede aumentar hasta color cereza.

  • Reacción negativa: aparición de un color blanco lechoso o ligeramente azuloso.


Controles

  • Positivo: usar M. tuberculosis H37-Rv u otro CU conocido de M. tuberculosis.

  • Negativo: usar un CU conocido del complejo M. avium o agua destilada estéril.


  1. Prueba de termoestabilidad o inhibición de la enzima catalasa 68°C pH=7:

Fundamento: La catalasa es una enzima intracelular soluble que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno (2H2O2 = 2H2O + O2). La liberación de oxígeno produce burbujas en la mezcla reactiva indicando la presencia de catalasas. Las micobacterias poseen varios tipos de catalasas que varían según su estabilidad al calor. Las diferencias cuantitativas de actividad de las catalasas pueden determinarse mediante algunas de las siguientes pruebas: (a) método a temperatura ambiente o de la gota (indica presencia de catalasas), (b) prueba semi-cuantitativa (indica el nivel de producción de catalasas), (c) prueba a 68°C y pH de 7 (indica la pérdida de actividad de las catalasas debida al calor).

Reactivos

- Solución amortiguadora de fosfato 0,067M a pH 7,0

(Solución 1)

Na2HPO4 (anhidro)...........................................................................9,47 g

Agua destilada.............................................................................. 1000 mL

Disolver el fosfato disódico en agua destilada para obtener una solución 0,067M.

(Solución 2)

KH2PO4...........................................................................................9,07 g

Agua destilada..............................................................................1000 mL

Disolver el fosfato monopotásico en agua destilada para obtener una solución 0,067M.

Para preparar la solución buffer fosfato a pH 7, mezcle 61,1 mL de la solución 1 con 38,9 mL de la solución 2. Chequee en un Phmetro.

- Solución de Tween al 10%

Tween 80.............................................................................................10 ml

Agua destilada.....................................................................................90 ml

Coloque en el autoclave a 121°C durante 10 minutos. El Tween puede precipitar durante la esterilización y en ese caso habrá que resuspenderlo por agitación inmediatamente después de esterilizar y mientras se enfría. Mantenga a 4oC.

  • Peróxido de hidrógeno al 30%, almacenado a 4°C.

Justo antes de comenzar la prueba, mezcle en partes iguales el Tween 80 al 10% y el peróxido de hidrógeno al 30%. Calcule 0,5 mL de reactivo para cada cultivo. Use guantes para manipular la solución de peróxido.

Procedimiento:

  1. Tomar con el asa varias colonias de un CU de aproximadamente 3 semanas de incubación, y suspender en 0.5 mL de solución amortiguadora fosfato, pH=7 o agua destilada estéril.

  2. Colocar durante 30 min los tubos en Baño de María calentado a 68°C.

  3. Retirar los tubos y dejar enfriar a temperatura ambiente.

  4. Agregar 0,5 ml de la mezcla recién preparada de peróxido y Tween 80 a los tubos y vuelven a colocar las tapas sin ajustarlas.

  5. .Conservar los tubos negativos durante 20 minutos antes de descartarlos.

  6. Lectura: para la observación puede utilizarse un microscopio estereoscópico o una lupa. La reacción positiva estará determinada por el desprendimiento activo de oxígeno de las colonias y la formación de burbujas en la superficie.

Controles

Negativo: M. tuberculosis es negativo después de calentar a 68°C

Positivo: M. avium es positivo después de calentar a 68°C


Otras técnicas para la identificación del complejo M. tuberculosis.


Test de identificación rápida por ensayo de inmunocromatografía para la detección antígeno (Ag) MPT64: Este ensayo se basa en la detección del Ag MPT64, presente solamente en el complejo Mycobacterium tuberculosis.

Preparación del inóculo:

- CU líquido: tomar 100 μL del medio de CU líquido positivo a BAAR.

- CU sólido: tomar de 3 a 4 colonias del medio sólido, positivo a BAAR y resuspender en 200 μL del buffer o agua destilada estéril; también puede utilizarse 100 μL del fluido de condensación de los tubos y aplicarlo directamente.

Procedimiento del Test:

- Adicionar 100 μL del cultivo líquido y/o 100 μL de la suspensión bacteriana o fluido de condensación en la ventana para inocular la muestra.

- Interpretar los resultados a los 15 minutos.

Interpretación del test.

- Resultado Negativo: La presencia de una sola banda (banda control). Indica resultado negativo.

- Resultado positivo: La presencia de las dos bandas (banda control y la banda en la sección derecha de la ventana), indica resultado positivo.

- Invalidación del test: cuando no aparece ninguna banda y/o cuando no aparece la banda control.

Nota: La aparición de una banda de color fucsia en la sección izquierda de la ventana muestra que el test está funcionando satisfactoriamente (banda control) y La aparición de otra banda de color fucsia en la sección derecha de la ventana, indica los resultados de la muestra que se está analizando. La intensidad del color de la banda depende de la concentración del Ag MPT64.

  1. Prueba de fotocromogenicidad; ésta se realiza, en especial, a las cepas niacina negativa y catalasa positiva:

  1. Se prepara una suspensión bacteriana de aproximadamente 1 mg/mL y se inoculan 2 tubos con una asada en toda la superficie del medio.

  2. Se cubre con papel negro uno de los tubos y se incuban ambos con las tapas flojas.

  3. Se observa el tubo descubierto cada 48 horas hasta los 7 días y luego semanalmente hasta detectar, a simple vista, crecimiento evidente. Se descubre el tubo cubierto y pueden haber ocurrido 2 eventualidades:

  • Que la cepa haya producido pigmento de color amarillo naranja en ausencia de la luz; en este caso se clasifica como escotocromógena.

  • Que no se haya producido pigmento en la oscuridad, en cuyo caso procedemos como sigue:

  • El tubo que estaba cubierto se expone a la luz directa de un bombillo de 40 W a 40 cm durante 2 horas

  • Se cubre de nuevo con el papel negro, se incuba y se observa a las 48 horas y a los 7 días, si la cepa ha producido pigmento se clasifica como fotocromógena; si no se clasifica como no cromógena.

Con las anteriores pruebas se puede identificar M. tuberculosis y agrupar las micobacterias llamadas "atípicas", según el esquema mínimo (tabla I.III).

Para identificar M. bovis y el resto de las micobacterias es necesario el empleo de otros esquemas de pruebas.

Para la re-identificación, clasificación y tipificación de las micobacterias las cepas se tienen que enviar al LNR-TB del IPK.

Tabla I.III. Esquema de identificación general de micobacterias

Micobacterias

P. de Niacina

P. Cat. 68°C

P. luz

V/crec.

M. tuberculosis

+

-

No pigm.

3 a 5 semanas

M. bovis

-

-

No pigm.

3 a 8 semanas

M. bovis BCG

-

-

No pigm.

3 a 8 semanas

Tabla I.IV: Clasificación de acuerdo al criterio de Runyon

Micobacterias

P. de Niacina

P. Cat. 68°C

P. luz

V/crec.

M.Grupo I





Fotocromógena

+

- (x)

Pigm. a

la luz

3 a 5 semanas

M.Grupo II





Escotocromógena

-

+

Pigm. en oscuridad

3 a 5 semanas

M.Grupo III





No fotocromógena

-

+(xx)

No pigm.

3 a 5 semanas

M.Grupo IV

-

(xxx)

+

1 a 7 días.

Leyenda:

P. Niacina: prueba de niacina.

P. Cat. 68°C: prueba de catalasa a 68°C, pH=7.

P. pigm.: producción de pigmento

P. Luz: producción de pigmento en presencia de luz.

V/crec.: velocidad de crecimiento.

(x) excepto M. simiae (M. habana) Niacina fuertemente positiva.

(xx) excepto M. gastri.

(xxx) excepto M. borstelense var. niacinógena (niacina positiva).

Informe

Se informará la micobacteria aislada, identificada de acuerdo con el esquema de identificación establecido (tabla I.IV).

Si no hay crecimiento, se informa como negativo y si se han contaminado los dos tubos sembrados, el CU se informa como contaminado, y se manda a repetir.


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