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CAPÍTULO 16 

MÉTODOS ESPECTROQUÍMICOS

a los distintos niveles vibracionales del estado excitado, como S

1

. Naturalmente, la subes-

tructura también se debe a diferentes niveles rotacionales en cada nivel vibracional.

La longitud de onda máxima de absorción y la mínima de fluorescencia tienden a 

ser iguales (la transición 0-0 en la figura 16.29). Sin embargo, con más frecuencia éste no 

es el caso, debido a diferencias en la solvatación de la molécula excitada y la molécula en 

estado fundamental. Son diferentes los calores de solvatación de cada una y eso causa 

disminución de la energía del fotón emitido en una cantidad igual a esos dos calores de 

solvatación.

Sólo pueden fluorescer las moléculas que absorben la radiación, en general la radia-

ción ultravioleta; de las que sí absorben, sólo fluoresce 5 a 10%. Es una ventaja cuando 

se considera una posible interferencia en la fluorescencia. La radiación emitida puede 

estar en la región ultravioleta, en especial si el compuesto absorbe a menos de 300 nm, 

pero en general está en la región visible. La radiación emitida es la que se mide y se re-

laciona con la concentración.

ESTRUCTURA QUÍMICA Y FLUORESCENCIA

En principio, cualquier molécula que absorba radiación ultravioleta podría fluorescer. Hay 

muchas razones para que esto no suceda, pero no se examinarán aquí y sólo se hará notar, 

en general, qué clases de sustancias se espera que sean fluorescentes.

En primer lugar, cuanto mayor sea la absorción por una molécula, la intensidad de 

fluorescencia será mayor. Muchos compuestos aromáticos y heterocíclicos fluorescen, en 

especial si contienen ciertos sustituyentes. Los compuestos con varios dobles enlaces con-

jugados favorecen la fluorescencia. Uno o más grupos donadores de electrones, como 

¬

OH,  ¬NH

2

 y ¬OCH

3

 aumentan la fluorescencia. Los compuestos policíclicos, como 

la vitamina K, las purinas y los nucleósidos, así como los polienos conjugados como la 

vitamina A, son fluorescentes. Los grupos como ¬NO

2

,  ¬COOH,  ¬CH

2

COOH,  ¬Br, 

¬

I y los grupos azo tienden a inhibir la fluorescencia. La naturaleza de otras sustancias 

puede alterar el grado de fluorescencia. En muchas moléculas, la fluorescencia depende 

mucho del pH en los casos donde sólo la forma ionizada o no ionizada puede ser fluores-

cente. Por ejemplo, el fenol, C

6

H

5

OH es fluorescente, pero su anión, C

6

H

5

O

, no lo es.

Si un compuesto no es fluorescente puede convertirse en un derivado que sí lo sea. 

Por ejemplo, los esteroides no fluorescentes se pueden hacer fluorescentes por deshidra-

tación con ácido sulfúrico concentrado. Esos alcoholes cíclicos se convierten en fenoles. 

De igual modo, los ácidos dibásicos, como el ácido málico, pueden reaccionar con 

-naf-

tol en ácido sulfúrico concentrado y formar un derivado fluorescente. White y Argauer han 

desarrollado métodos fluorométricos para muchos metales, formando quelatos con com-

puestos orgánicos (véase la referencia 23). Los anticuerpos pueden hacerse fluorescentes 

condensándolos con isocianato de fluoresceína, que reacciona con los grupos amino libres 

de las proteínas. El NADH, la forma reducida del dinucleótido de adenina y nicotinamida, 

fluoresce. Se trata de un producto o reactivo (cofactor) en muchas reacciones enzimáticas 

(véase el capítulo 24), y su fluorescencia es la base de la sensible cuantificación de enzimas 

y sus sustratos. La mayor parte de los aminoácidos no fluoresce, pero se forman derivados 

fluorescentes por reacción con cloruro de dansilo.

EXTINCIÓN O APAGADO DE LA FLUORESCENCIA

Una dificultad que se encuentra en la fluorometría es la de la extinción o apagado de 

la fluorescencia causada por muchas sustancias, las cuales, de hecho, compiten por reci-

bir la energía de excitación electrónica y disminuyen el rendimiento cuántico (la eficiencia 

de conversión de la radiación absorbida en radiación fluorescente; véase más adelante). El 

ion yoduro es un extinguidor muy efectivo. Los grupos con sustituyentes yoduro y bromu-

ro hacen bajar el rendimiento cuántico. Sustancias como éstas se pueden determinar indi-

Con frecuencia, la extinción de 

la fluorescencia es un problema 

en las mediciones cuantitativas.

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