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606

 

CAPÍTULO 21 

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

FASES ESTACIONARIAS

Las micropartículas en la HPLC original eran de gel de sílice o de alúmina, irregulares, 

porosas, de 10 

m o menos. Desde entonces se han desarrollado partículas esféricas que 

se pueden empacar en forma más homogénea y permiten alcanzar mayor eficiencia (véase 

figura 21.4). Las partículas son de sílice de alta pureza, con bajo contenido de trazas de 

metales, y su diámetro típico es de 5 a 10 

m; sin embargo, las partículas de 3 m se están 

usando cada vez más en la cromatografía de alta velocidad (que se describirá adelante). Los 

tamaños de poro están en el intervalo de 60 a 100 Å, aunque se usan tamaños de poro de 

300 Å o más con biomoléculas más grandes, que les permiten penetrar los poros.

La mayor parte de las separaciones con HPLC se lleva a cabo en el modo líquido-

líquido (cromatografía de partición), aunque la cromatografía de adsorción es útil para 

muchas aplicaciones. Las fases estacionarias líquidas se encuentran cubriendo a las partí-

culas o químicamente enlazadas.

Figura 21.2. 

Cromatógra-

fo de líquidos de alta eficien-

cia. (Cortesía de Agilent 

Technologies.)

H

B

H

C

H

Velocidad lineal promedio de la fase móvil, 

µ (cm/s)

Figura 21.3. 

Gráfica de Van Deemter 

para HPLC.

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21.1  CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICIENCIA

 

607

Las partículas que se usan con mayor frecuencia son las partículas microporosas o 

difusivas, permeables al disolvente (véase figura 21.5a). La superficie en su mayor parte está 

dentro de los poros. La fase móvil se mueve en torno a las partículas y el soluto se difunde 

entrando a la fase móvil estancada dentro de los poros e interactúa con la fase estacionaria; 

a continuación se difunde saliendo del poro y entra a la fase móvil. El uso de partículas pe-

queñas reduce al mínimo la longitud de la trayectoria de difusión, y en consecuencia el en-

sanchamiento de la banda. Las partículas de la figura 21.4 son microporosas. La figura 21.6 

muestra una partícula esférica de agregados, con 50% de porosidad y 100 Å de tamaño de 

poro. También se ve una de uso muy frecuente, con estructura esponjosa y 70% de porosidad, 

con el mismo tamaño nominal de poro pero mayor superficie; sin embargo, tiene mayor 

distribución de tamaños de poro y menor resistencia a la solubilidad en solución alcalina.

La de sílice tiende a disolverse a un pH mayor que 8, y así para la separación de bases 

se usan partículas poliméricas entrecruzadas, por ejemplo, de poliestireno o polimetacrilatos. 

Pueden resistir fases móviles fuertemente básicas, pero tienen eficiencias algo menores.

Las partículas de sílice tienen grupos silanol, ¬SiOH, superficiales. Éstos se usan 

para unir químicamente fases estacionarias mediante reacciones de silanización con clo-

rosilanos:

  

CH

3

  

CH

3

 



 

¬

Si ¬OH 

 Cl ¬Si¬R → ¬Si¬O ¬Si¬R  HCl

 



  

CH

3

  

CH

2

Más o menos la mitad de los grupos silanol se unen químicamente, y el resto se “recubre” 

con grupos trimetilsililo para hacerlos inertes. También Zorbax prepara partículas en las 

que los enlaces siloxano están protegidos por impedimento estérico de parte de los volu-

 CH

3

 



minosos grupos ter-butilo, ¬¬CH

3

, que son más grandes que los dos grupos metilo en

 



 CH

3

el agente derivatizante de organoclorosilano.

Las fases no polares enlazadas más comunes (para cromatografía de fase inversa) 

son las que poseen C

18

 y C

8

 (se mostraron antes); el más popular es C

18

 (llamado ODS, 

de octadecilsilano);  el  C

tiene hidrofobicidad intermedia y el C

18

 es no polar. También 

son útiles los grupos fenilo [R 

 (CH

2

)

3

C

6

H

5

]. Las partículas con C

5

 se usan para HPLC-

masas debido a sus bajas propiedades de sangrado. Las fases polares para cromatogra-

Figura 21.4. 

Partículas esfé-

ricas de sílice porosa, 10 

m; 

aumento 800

. Las partículas 

son totalmente porosas, con 

poros de 100 Å. Se encuentran 

disponibles como sílice base 

para cromatografía de adsor-

ción, o con fases adheridas 

(Astrosil

®

 de Stellar Phases, 

Inc. Cortesía de Stellar Phases, 

Inc.)

a) Partícula microporosa

b) Partícula de perfusión

Microporos

Macroporos

Película de líquido o

de intercambio iónico

c) Partícula no porosa

Núcleo

inerte

Figura 21.5. 

Tipos estructurales de partículas usadas en HPLC. (Según D. C. Scott, en Mo-

dern Practice of Liquid Chromatography, J. J. Kirkland, ed., Nueva York: Wiley-Interscience, 

1971; reproducción autorizada.)

 CH

3

 



¬

O ¬Si -^^^^

 



 CH

3

 CH

3

 



¬

O ¬Si ¬CH

3

 



 CH

3

 CH

3

 



¬

O ¬Si -^^^^

 



 CH

3

Recubrimiento. La mitad de los 

grupos SiOH libres ha sido re-

cubierta.

-^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^

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