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CAPÍTULO 21 

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

sensibles a los cambios de temperatura, por lo cual, si la columna trabaja a temperatura 

mayor que la ambiente, debe colocarse una chaqueta de enfriamiento entre el extremo de 

la columna y el detector, para regresar la temperatura de la fase móvil a la ambiental.

Entre el inyector y la columna analítica se instala un guardacolumna o precolumna 

pequeño, de 3 a 10 cm. En general contiene el mismo empaque que la columna analítica. 

Se instala allí por dos razones. La primera es que retiene basura (por ejemplo, fragmentos 

de sellos de bomba) y materia sólida proveniente de la muestra que de otro modo llegarían 

a la columna, la ensuciarían y modificarían su eficiencia y selectividad. En segundo lugar, 

se retienen compuestos que se retienen muy fuertemente, que de otra manera quedarían 

atrapados en la columna analítica, sin eluirse. El guardacolumna prolonga la duración de la 

columna analítica. Periódicamente debe sustituirse o regenerarse. Algunas columnas analí-

ticas tienen integrado un guardacolumna, diseñado para eliminar casi todo el volumen muerto, 

por ejemplo con conexión a tope con la columna, para minimizar ensanchamientos adicio-

nales de la columna. Entre la bomba y el inyector se puede instalar un filtro en línea.

4. Detector.  En la cromatografía de líquidos de alta eficiencia se requieren detectores con 

gran sensibilidad, en general para cantidades de microgramos a nanogramos. Los detectores 

que más se usan son refractómetros y detectores de ultravioleta (UV). El detector de re-

fractómetro diferencial, llamado con frecuencia “detector universal”, mide cambios en el 

índice de refracción del eluyente causados por la presencia de solutos al salir de la columna. 

No se puede usar bien en eluciones con gradiente debido a un cambio en la referencia 

(cambio en el índice de refracción del disolvente al cambiar el gradiente) ni cuando el di-

solvente tiene índice de refracción cercano al de los solutos. Como se dijo, es muy sensible 

a los cambios de temperatura. Este detector es robusto, y detecta concentraciones aproxi-

madas de 10

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 a 10

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 g/mL (10 a 1 ppm). El detector ultravioleta tiene mucho mejor 

selectividad, alrededor de 10

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 g/mL (0.01 ppm). No es sensible a la temperatura, cuesta 

relativamente poco y se puede usar con gradiente de elución. Es sensible a una gran canti-

dad de compuestos orgánicos. Debido a sus ventajas, con el detector UV se hacen cerca de 

80% de las mediciones. Es claro que no se puede usar con disolventes que tengan absorción 

apreciable en el UV o con componentes de muestra que no absorban en el UV.

Muchos detectores de UV son sencillos filtros de interferencia que pueden medir la 

absorbancia sólo a unas cuantas longitudes de onda predeterminadas. Los detectores más 

costosos tienen un monocromador que permite seleccionar determinada longitud de onda. 

Incluso se puede lograr recorrer el espectro, para identificaciones cualitativas, deteniendo 

de manera momentánea el flujo de la fase móvil. El detector más popular en HPLC es 

el de longitud de onda variable UV-Vis. Puede medir nanogramos de analitos absorbentes de 

UV o los que tengan cromóforos adecuados que absorban en la región visible. Las colum-

nas analíticas pueden manejar muestras de 100 

L, por lo que estos detectores pueden 

medir, en casos favorables, concentraciones de 10 ppb (1 parte en 1 000 millones).

Una característica común de los instrumentos de HPLC es un detector de serie de 

diodos, como se describió en el capítulo 16. La adquisición instantánea del espectro de ab-

sorción proporciona una poderosa herramienta cualitativa. La fuente de radiación focal 

pasa a través de la celda de detector de flujo y es dispersada por una rejilla a una serie de 

fotodiodos para su detección. La capacidad para resolver espectros matemáticamente so-

lapados proporciona capacidad adicional de separación cuando un máximo cromatográfico 

consiste en dos o más analitos.

Los detectores de fluorescencia pueden tener mejor selectividad que los de absorción 

ultravioleta porque son menos los compuestos que fluorescen que los que absorben (véase 

el capítulo 16). Se alcanzan sensibilidades cuando menos iguales, y quizá mejores que las 

del detector de UV, dependiendo de la geometría de la disposición fuente de excitación-

detector, la intensidad de la fuente y la eficiencia cuántica del fluoróforo. El detector 

amperométrico (véase el capítulo 15) es adecuado para detectar sustancias electroactivas, 

y ha encontrado muchos usos en aplicaciones biológicas, por ejemplo, en la separación y 

detección de trazas de catecolaminas en el cerebro mediante HPLC.

Un guardacolumna prolonga la 

vida de la columna analítica y 

mejora las separaciones al remo-

ver compuestos de muy elevada 

retención y también basura.

Un detector de serie de diodos 

proporciona poder adicional de 

resolución e incluso identifica-

ción a nivel de huellas digitales.

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