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21.1  CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICIENCIA

 

613

Al configurar el aparato, debe haber un “volumen muerto” mínimo entre la conexión 

de inyección y la columna, y entre la columna y el detector, para minimizar el ensancha-

miento de los máximos y para obtener la máxima eficiencia. En general, se puede usar un 

capilar de 20 cm de acero inoxidable para conectar la columna con el detector sin afectar 

mucho la eficiencia de ésta. También el volumen del detector debe ser pequeño, y los 

volúmenes normales son del orden de 1 

L, y en los detectores de alto rendimiento usados 

con sistemas capilares de cromatografía de líquidos se usan volúmenes menores al micro-

litro. Una celda espectrofotométrica de flujo suele tener una configuración de “celda Z”, 

con ventanas de cuarzo, donde la trayectoria de la luz sigue el eje de un tramo horizontal 

del flujo de efluente, para aumentar la trayectoria de la absorbancia y la sensibilidad.

DESARROLLO DEL MÉTODO HPLC:

¿QUÉ COLUMNA? ¿QUÉ DISOLVENTE?

La cromatografía de líquidos de alta eficiencia se usa en el modo de cromatografía de 

adsorción líquido-sólido, o en el de cromatografía de partición líquido-líquido. El más 

común es el modo de partición, ya sea normal o de fase inversa. Tanto la cromatografía 

de partición como la de adsorción aprovechan diferencias en la polaridad del soluto, por-

que la polaridad es importante para determinar tanto la adsorción como la solubilidad. Los 

procesos de partición líquido-líquido son bastante sensibles a pequeñas diferencias en el 

peso molecular, por lo que se prefieren para separar miembros de series homólogas. Por 

otra parte, los procesos de adsorción son sensibles a los efectos estéricos, y se prefieren 

para separar isómeros con distintas configuraciones estéricas. Las fases más frecuentes de 

adsorción son partículas de alúmina o de sílice.

Como regla general, los materiales muy polares se separan mejor con cromatografía 

de partición, en tanto que los que son mucho menos polares se separan con cromatografía de 

adsorción. Entre los extremos, se podría aplicar cualquiera de los procesos. La polaridad 

de los compuestos tiene el orden aproximado siguiente: hidrocarburos y derivados 

 hidro-

carburos oxigenados 

 donadores de protones  compuestos iónicos; esto es, RH  RX  

RNO

2

 

 ROR (éteres)  RCO

2

R (ésteres) 

 RCOR (cetonas)  RCHO (aldehídos)  

RCONHR (amidas) 

 RNH

2

, R

2

NH, R

3

N (aminas) 

 ROH (alcoholes)  H

2

 ArOH 

(fenoles) 

 RCO

2

H (ácidos) 

 nucleótidos  



NH

3

RCO

2

(aminoácidos). En la cromato-

grafía de adsorción suele mantenerse constante al adsorbente y se hace aumentar la polaridad 

del disolvente de elución, hasta que se completa la elución. Algunos disolventes de uso común, 

por polaridad creciente, son: disolventes ligeros de petróleo (hexano, heptano, éter de petró-

leo) 

 ciclohexano  tricloroetano  tolueno  diclorometano  cloroformo  éter etílico 

 acetato de etilo  acetona  n-propanol  etanol  agua. En algunas circunstancias se 

podrá necesitar un disolvente tan polar en la elución, que muchos solutos se estarán eluyendo 

juntos en lugar de separarse. En esos casos se debe usar un adsorbente menos polar.

En la cromatografía de fase normal (NPC, normal-phase chromatography) la fase 

estacionaria es polar. Se usa una fase móvil no polar, como n-hexano, cloruro de metileno 

o cloroformo. La fase estacionaria es un siloxano unido con un grupo funcional polar 

(orden de polaridad: ciano 

 diol  amino  dimetilamino). Esas fases retienen com-

puestos polares preferentemente a compuestos no polares.

En la cromatografía de fase inversa (RPC, reversed-phase chromatography) se usa 

una fase estacionaria relativamente no polar, y la fase móvil polar es, por ejemplo, metanol, 

acetonitrilo, tetrahidrofurano, agua o, con frecuencia, una mezcla de agua con uno de los 

disolventes orgánicos. El disolvente orgánico se llama modificador, y el más común es 

acetonitrilo. El contenido de agua se hace variar para ajustar la polaridad. Con los com-

puestos ácidos se usa metanol, y para los básicos se usa acetonitrilo. El tetrahidrofurano 

se usa para los que tienen grandes dipolos. Estos disolventes son transparentes al UV y 

tienen poca viscosidad. Las fases enlazadas más comunes son cadenas de n-octadecilo (C

18

o  n-decilo (C

8

), o grupos fenilo. Las columnas polares, de fase inversa, como polietilen-

glicol (PEG) contienen grupos éter que interactúan con analitos polares. Se usan para 

analizar compuestos fenólicos y multiaromáticos con grupos hidroxilo. Si bien muchos de 

La HPLC de fase inversa se 

usa para separar compuestos or-

gánicos.

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