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CAPÍTULO 21 

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

ellos se pueden separar en columnas con C

18

, se pueden presentar traslapos. Cabe esperar 

que los órdenes de elución sean diferentes.

Una gran variedad de compuestos orgánicos se pueden disolver en fases mixtas de 

agua-disolvente orgánico para separarlos, de tal modo que la cromatografía de fase inversa 

es, con mucho, la forma más difundida de HPLC. Para los compuestos que se pueden se-

parar por NPC o por RPC, el orden de elución se invierte, si bien no siempre es exacto. 

Naturalmente, si una muestra es mucho menos polar e insoluble en mezclas acuosas, se usa 

cromatografía de fase normal. En los demás casos se usa cromatografía de fase inversa.

1. Selección del disolvente.  En contraste con la cromatografía de gas-líquido, donde la 

fase móvil gaseosa se encuentra fija y las condiciones de separación se cambian variando 

la fase estacionaria polar, en la cromatografía de partición líquido-líquido se puede variar la 

fase móvil, esto es, la “fuerza del disolvente”. Esto es más fácil de hacer que cambiar 

columnas, y el ajustar la fase móvil es parte del desarrollo en los métodos de separación 

de cromatografía de líquidos.

En la mayor parte de las aplicaciones, con un disolvente puro no se obtendrá la se-

paración eficiente de una serie de compuestos, y deberá usarse una formulación con dos 

o más disolventes. El disolvente débil se llama disolvente A, y el fuerte se llama disolvente 

B. Para obtener un porcentaje óptimo del disolvente B se pueden hacer tanteos. Interesan 

dos factores para lograr separaciones eficientes con resolución de línea de base: el factor 

de retención k, que es un término de polaridad, y el factor de separación 

, que es un 

término de selectividad (véase la ecuación 19.28). En general se trata de ajustar la con-

centración del disolvente para colocar todas las bandas de soluto dentro de un intervalo de 

k de aproximadamente 0.5 a 20. El ajuste a una polaridad aceptable permitirá que la reso-

lución sea adecuada para muchos compuestos. Si la separación es incompleta, un cambio 

en % B, por ejemplo de 35 a 40 o 45% causará con frecuencia un cambio importante en 

el espaciamiento de las bandas, y producirá una mejor resolución. Pero aunque en ese caso 

algunas bandas pueden estar mejor separadas, otras se pueden traslapar, lo que no podría 

haber sucedido antes. Por ejemplo, una mezcla de dos disolventes, acetonitrilo y metanol, 

con agua, puede producir una separación intermedia de bandas con resolución aceptable,  como 

se ve en la figura 21.10. Los dos experimentos, con 80 y 40% de acetonitrilo (ACN) dan 

una idea del intervalo de valores de k en relación con la concentración del disolvente; con 

20% ACN 

+ 25% MeOH

80% ACN

10

0

10

0

40% ACN

50% MeOH

10

1

2

4

5

6

7

3

0

10

1

2

4

5

6

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3

0

Figura 21.10. 

Serie hipotética de experimentos para desarrollo de un método, comenzando 

con una fase móvil concentrada de acetonitrilo 80% y agua. (Según L. R. Snyder, J. J. Kirkland 

y J. L. Glajch, Practical HPLC Method Development, 2a. ed., Nueva York: Wiley-Interscience, 

1998. Reproducción autorizada.)

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