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21.1  CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICIENCIA

 

615

40% de ACN se obtiene mayor resolución, pero todavía incompleta. Al cambiar de ACN 

a metanol (MeOH) al 50% cambia el espaciamiento, pero se producen nuevos traslapos. 

Por último, al mezclar los dos disolventes (volúmenes iguales de ACN 40% y MeOH 50% 

que se usaron antes) se obtiene una separación intermedia entre las dos, con resolución 

aceptable. Este método de varios disolventes funciona bien en muchos casos.

2. Diferencias entre las columnas.  Hay más de 100 diferentes marcas comerciales 

de columnas de fase inversa. Los fabricantes de columnas proporcionan información como 

el número de platos, selectividad única, reproducibilidad, caída de presión, etc. No obstante, 

si bien es importante tener conocimiento de todos estos datos, resultan de poca ayuda para 

seleccionar la columna más apropiadda para la mayoría de las aplicaciones.

Si bien no se han desarrollado índices similares a los que se encuentran disponibles 

para la cromatografía de gases, se ha tratado de clasificar las columnas. Una de estas for-

mas consiste en usar un solo compuesto, como aspirina, para caracterizar una serie de 

columnas con un analito de polaridad fija para determinar el tiempo relativo en el que éste 

se eluye. Otra es usar un método quimiométrico (estadístico) para agrupar las columnas 

de acuerdo con la eficiencia, simetría del máximo, formación de colas en el máximo y 

silano libre. Esos métodos, al presente, tienen valor limitado para discernir diferencias 

relativamente pequeñas. Lo que se puede decir es que la mejor manera de seleccionar la 

columna adecuada es la evaluación empírica, comenzando con las aplicaciones recomen-

dadas por el fabricante.

3. Gradiente de elución. En cromatografía de gases se describió cómo se pueden 

mejorar y acelerar las separaciones mediante programación de temperaturas; pero en HPLC 

esta opción está limitada (sin embargo, véase la discusión acerca de la cromatografía rápida 

más adelante para excepciones). Un método más viable que no está disponible en la cro-

matografía de gases es emplear elución con gradiente de fase móvil. La cromatografía de 

líquidos con gradiente de elusión es una de las formas más efectivas para separar varios 

analitos que tienen tiempos relativos de retención diferentes. En la elución isocrática (con 

la misma polaridad) en general hay mala resolución de máximos al iniciar el cromatograma 

y ensanchamiento de máximos con tiempos de retención más grandes. En la cromatografía 

de fase inversa el gradiente se consigue aumentando la fracción de disolvente orgánico 

modificador (por ejemplo, metanol). Esto permite eluir compuestos débilmente retenidos 

más tardíamente para resolverlos mejor de lo que sería con una elución isocrática, y los 

que se retienen más se eluirán más rápido para producir un cromatograma con máximos 

compactos y bien espaciados, con una mejor forma de pico y menores límites de detección 

debido a que se reduce el ensanchamiento de bandas.

Como en la programación de temperatura en cromatografía de gases, el gradiente puede 

elevarse de manera escalonada o continua. Las bombas se programan para mantener constante 

el flujo total. El disolvente inicial debe tener una polaridad que eluya rápido y resuelva los 

primeros componentes; la concentración (polaridad) del disolvente se eleva hasta un valor 

que resuelva los últimos máximos en un tiempo razonable. El método con varios disolven-

tes que se describió antes puede ayudar a determinar las polaridades inicial y final.

Uno de los problemas que se encuentran en el gradiente de elución en cromatografía 

de fase inversa es que la columna se debe reequilibrar con el disolvente inicial entre corridas. 

Para eso se requiere lavar con 15 a 20 volúmenes de columna con la fase móvil inicial. John 

Dorsey, de la Universidad Estatal de Florida, elaboró un procedimiento que reduce en forma 

espectacular el tiempo de equilibrio cuando se controla la solvatación de las cadenas de 

alquilo enlazadas a lo largo de la corrida cromatográfica. [L. A. Cole y G. D. Dorsey, Anal. 

Chem.62 (1990) 16]. Una solución de propanol al 3% forma una cubierta de casi monocapa 

en una superficie de C

18

, y si se agrega 1-propanol al 3% a cada componente de fase móvil 

se reduce un 75% el tiempo de equilibrio. También, el efecto hidratante que produce el

1-propanol puede producir mayores eficiencias de columnas al inicio del cromatograma con 

una fase móvil inicial prominentemente acuosa. Véase también D. L. Warner y J. G. Dorsey, 

LC-GC15 (3) (1997) 254, con detalles adicionales sobre aplicaciones prácticas.

Véase una comparación muy de-

tallada de 60 fases de C

18

 en 

www.mac-mod.com/

comparison_guide.html. Éstas se 

clasifican por hidrofobicidad y 

polaridad relativas, y aparecen 

datos acerca de las eficiencias 

de la columna para compuestos 

básicos y neutros. Véase tam-

bién el informe completo de 

NIST en http://ois.nist.gov/

srmcatalog/certificates/870.pdf.

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