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CAPÍTULO 21 

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

El gradiente de elución funciona bien con la cromatografía de partición de fase en-

lazada y con la cromatografía de adsorción, pero es difícil de usar con la cromatografía 

líquido-líquido.

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA RÁPIDA: LO PEQUEÑO ES MEJOR

Si las columnas se acortan y se empacan con partículas más pequeñas, pueden hacerse se-

paraciones en la décima parte del tiempo que se requiere en HPLC convencional (del orden 

de 20 min), y algunas separaciones sólo requieren algunos segundos. Las columnas rápidas de 

cromatografía de líquidos (LC, liquid chromatography) tienen el mismo diámetro que las co-

lumnas convencionales, 4.6 mm, pero sólo tienen 1 a 3 cm de longitud, en vez de los 25 cm 

normales, y se empacan con partículas de 3 

m en vez de 5 m, trabajando dentro de 1 a 

3 mL/min. La gráfica de H en función de u

 es bastante plana a elevada rapidez de flujo 

(véase la figura 19.5), porque las partículas menos pequeñas son menos resistentes a la 

transferencia de masas (término C en la ecuación de Van Deemter). Las columnas son cor-

tas debido a la mayor contrapresión con las partículas más pequeñas; pero una columna típica 

puede generar 4 000 platos, los suficientes para muchas separaciones. En 30 s se han sepa-

rado hasta 20 máximos. Si bien no tienen gran resolución, estas separaciones resuelven 

muchos de los problemas analíticos en la industria farmacéutica, que ocupa más o menos la 

mitad del mercado de HPLC. En general, en el control farmacéutico los analistas necesitan 

buscar unos cuantos ingredientes activos en una tableta o formulación.

¿Por qué usar cromatografía de líquidos rápida? Además de la ventaja obvia de los 

análisis más rápidos, usa 50 a 80% menos de disolvente (generando menos desechos). La 

sensibilidad aumenta tres a cinco veces, porque hay menor dilución de los máximos de 

analito en los menores volúmenes de columna, resultado de un empacado más estrecho. 

Estas columnas, empacadas densamente, son más propensas a taparse. Entonces, antes del 

inyector se instala una columna o filtro secuestrante, además del guardacolumna que se 

instala antes de la columna.

Si se debe aumentar la resolución al usar esas columnas cortas, se puede ajustar la 

fase móvil para que todos los analitos se eluyan en un intervalo de k de 1 a 10 con una 

elución más lenta, por ejemplo 10 min en vez de 30 s. Se puede usar un modificador con 

50% de acetonitrilo en la cromatografía de líquidos de alta velocidad, o sólo con 20% para 

cromatografía de líquidos de alta resolución.

Como en la cromatografía de gases de alta velocidad, en la LC de alta velocidad se 

requieren detectores y circuitos electrónicos de respuesta rápida para medir los máximos 

de elución angostos (de 0.5 s o 3 

L) y rápidos. El detector debe tener una constante de 

tiempo capaz de medir la rapidez de cambio de la señal del orden de 50 a 100 ms o menos. 

La rapidez de muestreo del sistema de datos debe ser 

10 puntos/segundo, y con espec-

trómetros de arreglo de diodos 

5 escaneos/segundo. Esas mediciones son más propensas 

a efectos adicionales de ensanchamiento en la columna y se deben minimizar los volúme-

nes muertos, lo que requiere una celda de flujo de detección pequeña (

3 L), un inyec-

tor con baja dispersión (comercialmente disponible) y tubos de conexión más cortos y de 

pequeño diámetro. Las celdas de flujo más pequeñas tendrán longitud de trayectoria menor, 

por lo que se compromete algo la sensibilidad.

COLUMNAS DE PEQUEÑO CALIBRE: MAYOR

SENSIBILIDAD, MENOR USO DE DISOLVENTE

Si se hacen columnas más angostas, el resultado es una mayor detección debido a que los 

máximos son más angostos y altos. Si se inyecta una muestra de 4 

L en una columna de 

2.1 mm de diámetro se diluirá cinco veces menos, y el máximo será cinco veces más alto 

que cuando se inyecta en una columna de 4.6 mm de la misma longitud. La rapidez de 

flujo es proporcional al cuadrado del diámetro de la columna, y el flujo óptimo para tener 

la misma resolución es unas cinco veces menor para la columna más angosta; esto da como 

resultado una menor dilución volumétrica de la muestra. Naturalmente, se puede alcanzar 

Se obtienen separaciones más 

rápidas usando partículas 

más pequeñas y columnas más 

cortas.

Con columnas angostas mejora 

la sensibilidad.

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