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24.4 INMUNOENSAYOS

 

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midiendo. En general, no se desea tener incubaciones largas (se puede dañar el antígeno por 

exposición prolongada a las altas concentraciones de las proteínas plasmáticas, a los oxidan-

tes, etc.), por lo que en algunos procedimientos no se alcanza el punto de equilibrio.

SEPARACIÓN DEL ANTÍGENO UNIDO Y DEL ANTÍGENO LIBRE

Se usan varias técnicas para separar el antígeno unido del antígeno libre después de la 

incubación, con lo cual es posible determinar el porcentaje de unión mediante la respuesta 

de la marca. El complejo inmune es una sustancia proteica que se puede precipitar (des-

naturalizar) con altas concentraciones de diversas sales [por ejemplo, (NH

4

)

2

SO

4

, Na

2

SO

4

o con disolventes orgánicos (por ejemplo, acetona, etanol). La precipitación es uno de los 

métodos más usados. En general, el complejo precipitado se separa por centrifugación 

(aunque también se puede usar filtración) y entonces se puede medir la respuesta de la 

marca en cualquiera de las fases.

La técnica del doble anticuerpo también se usa mucho. En este caso se emplea un 

segundo anticuerpo para precipitar el complejo primario antígeno-anticuerpo. Este segun-

do anticuerpo se produce inyectando a un segundo animal la globulina gamma producida 

en el primer animal con el que se preparó el primer anticuerpo. Aunque con el uso de 

un segundo anticuerpo se introduce otra fuente de error, el método del doble anticuerpo 

tiene la ventaja de poder aplicarse en casi todos los inmunoensayos, y la separación es 

completa.

Entre otras técnicas de separación se hallan la electroforesis (capítulo 21) y la unión 

del antígeno o anticuerpo con una fase sólida para usarlos como reactivo.

ENSAYOS POR INMUNOFLUORESCENCIA

Los anticuerpos y los antígenos se pueden marcar con tintes fluorescentes para después 

medir la fluorescencia (ver la referencia 12). Este método es popular por la mayor facilidad 

de manejo de los reactivos en comparación con las sustancias radiactivas y el problema 

del decremento de la radiactividad en función del tiempo. Los colorantes de uso frecuente 

son el isotiocianato de fluoresceína (FITC, fluorescein isothiocyanate) y la lisamina roda-

mina B (RB 200). La proteína que se va a conjugar (reaccionar) con el tinte suele ser una 

mezcla de inmunoglobulinas y no debe contener otras fracciones de proteínas de suero 

porque la albúmina y otras globulinas se marcan con mayor facilidad que la globulina 

gamma, lo que haría que el método no fuese específico. Después del marcado se remueve 

el tinte sin reaccionar, y la proteína marcada se purifica mediante cromatografía de exclu-

sión de tamaño.

Con frecuencia, la fluorescencia de un antígeno marcado se apaga debido a una re-

acción inmunoquímica, y se puede medir la disminución de fluorescencia sin tener que 

hacer una separación física. Esto es la base de los inmunoensayos homogéneos, en con-

traste con los inmunoensayos heterogéneos, los cuales requieren una separación.

INMUNOENSAYOS ENZIMÁTICOS

En este método el marcador que se usa es una enzima, por ejemplo peroxidasa, y la acti-

vidad de la enzima sin reaccionar y el antígeno marcado se mide con una reacción enzi-

mática apropiada. También aquí, en estas técnicas, con frecuencia se inhibe la actividad 

de la enzima con una reacción inmunoquímica, y se puede medir la disminución de acti-

vidad en un sistema de inmunoensayo homogéneo. Estos inmunoensayos enzimáticos ho-

mogéneos se suelen usar para la medición de moléculas de bajo peso molecular, como la 

digoxina, las anfetaminas y los medicamentos de prescripción.

Los inmunoensayos enzimáticos se conocen en general como ensayos con inmuno-

sorbente unido a una enzima (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assays). Véase la 

descripción original en la referencia 13. En la figura 24.7 se aprecian los diferentes tipos. 

Éstos son análisis heterogéneos. 

Los ensayos homogéneos (más 

adelante) no requieren separa-

ciones.

En este caso la marca es un 

fluoróforo. Su fluorescencia se 

apaga por la reacción inmuno-

química.

La actividad del marcador enzi-

mático se inhibe por la reacción 

inmunoquímica.

En la prueba ELISA, el antí-

geno o el anticuerpo se adsorbe 

en una superficie de plástico.

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