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702

 

CAPÍTULO 25 

EL SIGLO DEL GEN

carril del gel cerca de la parte inferior, y el instrumento detecta la fluorescencia de cada 

banda de nucleótido (a la longitud de onda de emisión de cada una de las cuatro marcas 

de nucleótido).

A medida que se eluye y detecta cada nucleótido (los más pequeños salen primero), 

las señales de fluorescencia de las bandas se grafican y se obtiene un cromatograma. La 

figura 25.10 muestra un cromatograma parcial de un solo carril, barrido desde el fragmento 

más pequeño hasta el más grande. La computadora del instrumento, al conocer el color de 

cada banda que origina un máximo, imprime automáticamente el símbolo del nucleótido 

arriba de cada uno de ellos. La figura muestra sólo un pequeño segmento del cromatograma 

entero. Típicamente, se miden hasta 700 nucleótidos en una muestra; con mayor número 

de nucleótidos, el ensanchamiento de las bandas se vuelve excesivo como para lograr una 

detección exacta y sensible.

Lo que se acaba de describir es el método que usa el Proyecto del Genoma Humano, 

de patrocinio público. La National Science Foundation y los National Institutes of Health, 

en Estados Unidos, han patrocinado la preparación de bibliotecas de clones de cromosomas 

bacterianos artificiales (BAC, bacterial artificial chromosome). Los laboratorios participan-

tes replican las bibliotecas y ejecutan la secuenciación usando la técnica de secuenciación 

de escopeta.

Resumiendo el procedimiento de secuenciación de escopeta del genoma, los labora-

torios de secuenciación obtienen los clones BAC de las bibliotecas de clones BAC. Cada 

BAC contiene un fragmento grande del ADN genómico, de hasta 300 kb. Éstos se presen-

tan en forma aleatoria, por lo que es probable que cualquier gen esté presente sobre los 

BAC traslapados. Los BAC son replicados por el laboratorio usando una ADN polimerasa. 

Sólo se pueden secuenciar unos pocos cientos de nucleótidos cada vez, por lo que los BAC 

multiplicados por lo regular se fragmentan usando fuerzas de cizalla, y los fragmentos se 

insertan en un vector (por lo general un plásmido) para replicarlos. Los fragmentos mul-

tiplicados se secuencian entonces usando una mezcla de los cuatro nucleótidos, sus isó-

meros didesoxi y un cebador, para formar hebras complementarias de diferentes longitudes. 

Las hebras se separan por orden de tamaño por electroforesis, y el nucleótido terminal de 

cada una de ellas es identificado por su color. De esta manera se escribe la secuencia de los 

nucleótidos en la dirección 5

⬘ a 3⬘. La secuencia de las hebras traslapadas da la secuencia 

completa de la pieza de BAC.

1040

1120

1200

1280

1360

1440

1520

1600

C

C

C

C

C

C

C C

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

A

A

A

A

A

A

90

100

110

120

130

A

A

A

Figura 25.10. 

Cromatograma de bandas separadas. Cada máximo corresponde a uno de los 

cuatro colores, y la base de terminación está impresa arriba del máximo, en el mismo color. 

(Cortesía de DNA Sequencing Core, Universidad de Michigan.)

Phred y Phrap

La secuenciación del ADN genera inmensas cantidades de datos. Los máximos cro-

matográficos individuales se pueden traslapar, se pueden desplazar un poco respecto 

de su posición esperada, pueden tener una forma distorsionada, etc. Hay dos pro-

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