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Calibración con estándar interno

El profesor podrá darle un problema de dos componentes, n-hexano y n-heptano, e indicarle 

que agregue n-pentano a todas las soluciones como estándar interno. En este caso, prepare 

los estándares como lo hizo anteriormente, pero para el problema tome 25.00 mL y agre-

gue 5.00 mL de n-pentano. Calcule las relaciones de área del analito/área del n-pentano 

para la calibración. Vea una descripción del uso de estándares internos en el capítulo 20.

EXPERIMENTO 33  ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO

DE VITAMINA C EN JUGOS DE FRUTAS, USANDO CROMATOGRAFÍA

DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICIENCIA

27

Principio

Se someten a cromatografía directamente muestras de diversos jugos en una columna de 

intercambio aniónico de bases fuertes usando un detector de UV a 254 nm. Por compara-

ción de los tiempos de retención con el de un estándar de vitamina C (ácido l-ascórbico) 

se determina la presencia o ausencia de vitamina C. Para la determinación cuantitativa de 

la concentración de vitamina C en los jugos que la contienen se usan las mediciones de las 

áreas de los máximos.

Soluciones y reactivos necesarios

1.  Suministrados.  Solución de la fase móvil (1.36 g de KH

2

PO

4

/L de agua destilada 

desionizada), ácido l-ascórbico.

2.  Preparados.  Estándar de vitamina C. Pese 50 mg de ácido l-ascórbico con una 

exactitud de 0.1 mg, páselos a un matraz aforado de 50 mL y disuélvalos, y afore 

con agua destilada desionizada. Prepare esto el día en que se va a usar. Se trata de 

una solución al 0.1%. Prepare una serie de diluciones con ella para obtener estándares 

de 0.05 y 0.02%.

Procedimiento

1.  Calibración.  Pida a su profesor las instrucciones para manejar el instrumento, in-

cluyendo la atenuación adecuada. Tendrá una columna con una resina intercambia-

dora de aniones fuertemente básica. A una presión típica de 1 000 psi, la rapidez de 

flujo aproximada será de 0.5 mL/min.

 

 

Use una jeringa de 10 o de 25 

L e inyecte una alícuota de 10 L del estándar 

de vitamina C al 0.02% y registre el cromatograma. Repita con los estándares de 

0.05 y 0.1%. Mida los tiempos de retención y las áreas. Las áreas de los máximos 

se pueden obtener multiplicando su altura por el ancho a la mitad de su altura. Tam-

bién se pueden recortar y pesar los máximos, o bien el instrumento podrá imprimir 

las áreas integradas. Use una hoja de cálculo y trace una curva de calibración del 

área de los máximos en función de la concentración.

2.  Problema.  Se le darán tres o más jugos problema. Pueden ser bebidas comerciales, 

jugo de naranja, etc. Inyecte porciones de 10 

L y registre los cromatogramas. Se 

podrán obtener varios picos. Si tiene tiempo, corra al menos dos cromatogramas de 

cada uno. Comparando los tiempos de retención, identifique los jugos que contienen 

vitamina C. Mida las áreas de los máximos de vitamina C, y con la curva de cali-

bración, determine e informe las concentraciones de los problemas. Si se corrieron 

dos o más cromatogramas de los problemas, dé a conocer la concentración promedio 

y la desviación estándar si fueron más de dos. El máximo de la vitamina C podrá 

estar parcialmente encimado con otro. En ese caso, extrapole hasta la línea de base 

y mida el área a partir de la línea de base.

27

 La forma oxidada del ácido ascórbico, el ácido desoxiascórbico, no absorbe en la región UV, y no se detecta con 

este método. Para obtener resultados más cuantitativos, las muestras se deben tratar con un reductor, como H

2

S [vea 

Roe et al., J. Biol. Chem.174 (1984) 201] para reducir todo el ácido desoxiascórbico que haya.

CROMATOGRAFÍA

 

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