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CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

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CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

La especificidad es la capacidad de un método para distinguir el analito que se está midiendo de otras sustancias que pueden estar presentes en el material objeto de ensayo. El método propuesto debe contar también con la especificidad necesaria para que el compuesto se mida y se discrimine de otras sustancias estructuralmente similares. Esta característica depende predominantemente del principio de medición o sistema de detección utilizado. Ciertas técnicas instrumentales, como la espectroscopia por rayos infrarrojos de Fourier o la espectrometría de masas, pueden ser lo suficientemente específicas por sí solas como para ofrecer una identificación inequívoca. Con frecuencia estas técnicas se denominan métodos confirmatorios. En aquellos casos en que un resultado analítico no es lo suficientemente específico para fines reglamentarios, se suele estimar necesaria una identificación positiva mediante un método confirmatorio antes de adoptar medidas reglamentarias. Los métodos confirmatorios pueden considerarse métodos del Tipo I cuando ofrecen un resultado determinativo para cuantificar e identificar provisionalmente un analito dado y un procedimiento para verificar la identidad del analito de interés.

Otras técnicas, utilizadas conjuntamente, pueden ser capaces de conseguir un grado de especificidad análogo al de las técnicas confirmatorias. Por ejemplo, se puede verificar la especificidad mediante una combinación de métodos como la cromatografía en capa fina, la cromatografía gas-líquido y específica para un elemento y sistemas de detección que la acompañan, la formación de derivados característicos seguida de una cromatografía adicional o la determinación de los tiempos relativos de retención específicos del compuesto utilizando diversos sistemas cromatográficos de diferente polaridad. Tales procedimientos deben ser aplicables al límite máximo para residuos (LMRMV) del analito.

La especificidad de un método de selección no suele ser tan grande como la de un método determinativo, dado que los métodos de selección se benefician a menudo de un rasgo estructural común a un grupo o clase de compuestos. Estos métodos se incluyen por lo general en la categoría de métodos del Tipo III. No es de prever que las técnicas basadas en ensayos biológicos, inmunoensayos o respuestas cromogénicas sean tan específicas como las técnicas que identifican inequívocamente un compuesto. La especificidad de un método de selección puede aumentarse con una técnica cromatográfica o de separación de otro tipo.

Si el resultado de un ensayo resulta algo ambiguo o no ofrece una respuesta específica (es decir una reactividad cruzada con componentes de la matriz que no son aquéllos para los que se diseñó el análisis), pueden ser necesarios estudios que se aproximen a la concentración de la respuesta no específica del método de análisis para identificar los compuestos que respondan al sistema de detección. Si el método no es lo suficientemente específico, será necesario un procedimiento confirmatorio o de identificación para tipificar el analito de interés.

La precisión es una característica funcional importante de los métodos para el control de residuos. Esta característica es común a todos los métodos y, como se señaló anteriormente, puede que una precisión aceptable no dependa del tipo de método, sino de la concentración del analito en la muestra original. Existen varios tipos de precisión. La precisión entre laboratorios, o reproducibilidad, es el grado de coincidencia entre los resultados obtenidos aplicando el mismo método y utilizando material de ensayo idéntico en diferentes laboratorios. La variación en los análisis del material de ensayo realizados reiteradamente por un solo analista en un laboratorio es la repetibilidad. La variabilidad intralaboratorial entre analistas que realizan el mismo análisis es el sesgo dentro del laboratorio, que se debe sobre todo al error aleatorio. La precisión se suele expresar como una desviación típica (valor absoluto determinado experimentalmente). De más utilidad es la desviación típica relativa o coeficiente de variación. Este parámetro expresa la variabilidad en función de la concentración y se mantiene relativamente constante durante un intervalo de concentración dado.

A continuación se indican los límites de precisión de los métodos de análisis, en función de la concentración. Los valores recomendados tienen en cuenta la gran variedad de métodos, analitos, matrices y especies que se incluyen en el mandato del Comité y que se aplican habitualmente en los programas amplios de control de residuos.

Concentración

Coeficiente de variabilidad (CV)
(Repetibilidad)

1 µg/kg

35%

1 µg/kg ≤ 10 µg/kg

30%

10 µg/kg ≤ 100 µg/kg

20%

100 µg/kg

15%


La variabilidad que se consigue en el laboratorio en el que se elabora el método y donde existe una experiencia considerable suele ser menor que la alcanzada en los laboratorios que aplican más tarde el método y tienen menos experiencia al respecto. La versión final del método deberá perfeccionarse lo más posible utilizando procedimientos como el ensayo de rigurosidad para identificar sus puntos críticos de control y cerciorarse de que pequeños cambios en la aplicación del procedimiento analítico no influirán negativamente en sus resultados. Si un método no puede conseguir unos resultados aceptables en el laboratorio del patrocinador, sus resultados no serán normalmente mejores en otros laboratorios.

Cuando se preparen los datos analíticos que habrán de utilizarse para definir la variabilidad prevista y otras características funcionales del método, éste deberá ser aplicado por un analista que no haya participado directamente en su elaboración. Con este procedimiento se verificará la idoneidad de la descripción por escrito del método y se contribuirá a identificar los parámetros críticos que influyen en su funcionamiento.

El coeficiente de variación dentro del laboratorio deberá ser ≤ 15 por ciento cuando la concentración del analito sea mayor o igual a 100 µg/kg. Cuando la concentración del analito sea de  10 a 100 µg/kg, el coeficiente de variación dentro del laboratorio deberá ser ≤ 20 por ciento. Cuando la concentración de interés es inferior a 10 µg/kg, resulta aceptable un coeficiente de variación ≤ 30 por ciento.

Un método del Tipo III deberá ser capaz de identificar muestras que contengan una concentración de residuos en el tipo de interés. Cuando en un método semicuantitativo (de selección) se utilice una muestra que contenga un residuo superior al LMRMV, será necesario un nuevo análisis para adoptar medidas reguladoras. En estas circunstancias, la muestra deberá ser analizada mediante un método determinativo y un método confirmatorio con características funcionales definidas. Una característica útil de los métodos del Tipo III es su precisión en el LMRMV y justo por debajo de éste. La precisión puede ser algo menos importante por encima del LMRMV.

El error sistemático o sesgo del método es la diferencia entre el valor (medido) experimentalmente determinado y el resultado medio que se obtendría si se aplicara el procedimiento experimental al material de ensayo un número muy grande de veces. Los errores sistemáticos son siempre del mismo signo y magnitud. Por el contrario, el error aleatorio es variable en cuanto a su magnitud y signo y la media de los errores aleatorios puede ser cercana a cero si se somete a ensayo un número suficiente de muestras. La exactitud se expresa por lo general como porcentaje de recuperación del analito de interés. La recuperación se obtiene experimentalmente añadiendo directamente cantidades conocidas del analito a distintas porciones del material de ensayo y comparando la cantidad recuperada con la cantidad añadida. El porcentaje de recuperación de un analito añadido directamente a la matriz de la muestra es por lo general de un valor superior al que se obtiene experimentalmente cuando se aísla el mismo analito acumulado biológicamente en una matriz dada de la muestra. Se prevé que en concentraciones de analito relativamente altas, la recuperación se aproximará al 100 por ciento. En concentraciones inferiores o con métodos de varias fases que exigen extracciones, transferencias de disolvente, fases de concentración o cromatografía de absorción, la recuperación será inferior. La variabilidad de la recuperación del analito es habitualmente tan importante como el propio porcentaje de recuperación y deberá ser escasa.

Cuando el LMRMV para el analito es de 100 µg/kg o más y el método de análisis se puede aplicar con una precisión aceptable, se deberán obtener promedios de recuperación del 80 al 110 por ciento.

Cuando el LMRMV es de 10 a 100 µg/kg, la recuperación recomendada aceptable es del 70 al 110 por ciento y del 60 al 120 por ciento cuando el LMRMV es inferior a 10 µg/kg. Estos límites de recuperación son razonables si se inscriben en el contexto de la gran variedad de residuos, métodos, matrices y especies que normalmente se incluyen en un programa amplio de ensayo de residuos. La variabilidad en la recuperación deberá ser escasa, independientemente del porcentaje de recuperación.

Cuando en los métodos de análisis se utilizan procedimientos de dilución de isótopos u otros modelos internos apropiados de referencia con fines cuantitativos, pueden ser convenientes factores de corrección en caso de que la recuperación sea superior o inferior al 100 por ciento.

Las necesidades de exactitud de los diferentes tipos de métodos variarán según la aplicación prevista de los resultados. En general, los métodos deberán alcanzar su mayor exactitud en el  LMRMV. Puede que las necesidades de exactitud de los métodos confirmatorios no sean tan grandes como las de los métodos cuantitativos, dado que en la mayoría de los programas de control de residuos estos métodos sólo se aplican una vez que se ha determinado mediante un método cuantitativo que la concentración de residuos es superior al LMRMV. La mayoría de los métodos confirmatorios tienen un aspecto cuantitativo inherente que sirve como verificación adicional del método cuantitativo anteriormente aplicado. A continuación se indican las necesidades de exactitud propuestas para los métodos, que se basan en las consideraciones relativas a un programa amplio de ensayo de residuos antes expuestas.

Concentración

Intervalo de variación aceptable

1 µg/kg

-50 a +20%

1 µg/kg ≤ 10 µg/kg

-40 a +20%

10 µg/kg ≤ 100 µg/kg

-30 a +10%

100 µg/kg

-20 a +10%


Los métodos del Tipo III pueden ser convenientes para programas de control de residuos en diversos supuestos. Por ejemplo, podrían utilizarse en situaciones en que no se puede establecer ni existe por lo demás un LMRMV, y podrían adoptarse medidas reglamentarias en caso de que se encontrara cualquier cantidad de residuo de medicamentos. Los métodos no cuantitativos se pueden aplicar también cuando el LMRMV o el tipo de interés es inferior al límite de detección del método de selección. En ambos casos, es necesario evaluar los métodos propuestos para el ensayo de residuos especificado con el fin de determinar experimentalmente cuál es la concentración más baja en la que se puede detectar un analito y determinar la exactitud y límites del método utilizando datos relativos a respuestas negativas falsas (es decir, se obtiene un resultado analítico negativo cuando está presente el analito) y a respuestas positivas falsas (se obtiene un resultado positivo cuando no está presente el analito) en el LMRMV o por encima de éste.

Si los métodos del Tipo III requieren el empleo de un equipo de ensayo manufacturado, el fabricante deberá facilitar, como mínimo, datos sobre la exactitud, precisión, especificidad y límite más bajo de detección. Los usuarios deberán verificar la validez de estos datos mediante sus propios estudios y evaluar los resultados mediante inspecciones con miras al control de la calidad. La concentración más baja detectable de un analito deberá representar la cantidad menor de un analito que se puede observar o encontrar de modo fiable en la muestra objeto de ensayo. Un estudio científicamente correcto y estadísticamente válido, con los controles oportunos, deberá determinar la exactitud del método, expresada en función de las respuestas negativas y positivas falsas.

En general, los métodos no cuantitativos deberán ofrecer menos del 5 por ciento de respuestas negativas falsas y menos del 10 por ciento de respuestas positivas falsas cuando el análisis se lleva a cabo en la muestra objeto de ensayo. Estos valores pueden variar según el tipo de medida que se adopte como resultado del ensayo analítico. Se deberán elegir valores moderados, apropiados a las necesidades de los ensayos de residuos.

El límite de detección es la menor concentración medida de un analito de la que es posible deducir, con una certeza aceptable, la presencia de éste en la muestra objeto de ensayo. Esta determinación deberá tener en cuenta las interferencias relacionadas con la matriz en las que la razón de señal instrumental a perturbación (S/R) sea superior a 5:1, o la concentración determinada por un factor de tres desviaciones típicas de la respuesta de la señal en el caso del tejido en blanco, si ésta es inferior.

La sensibilidad es una medida de la capacidad de un método para detectar la presencia de un analito y discernir pequeñas diferencias en el contenido del mismo. Esto se puede determinar mediante la pendiente de la curva típica en las concentraciones de interés.


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